J Ethnopharmacol.｜福中医研究团队新发现！清解扶正颗粒精准操控巨噬细胞，让结直肠癌“刹车”！

英文标题：Mechanism of Qingjie Fuzheng Granules in inhibiting colitis associated colorectal cancer by regulating TLR4 and IL-4R mediated macrophage polarization

发表期刊：Journal of Ethnopharmacology

影响因子：5.4

合作单位：福建中医药大学

百趣提供服务：DIA中药入血组、中药NGM 2

清解扶正颗粒(QFG)是一种中药复方，已被用作结肠炎相关结直肠癌(CAC)的辅助治疗，但其作用机制尚不明确。福建中医药大学研究团队在Journal of Ethnopharmacology(IF=5.4)上发表了题为“Mechanism of Qingjie Fuzheng Granules in inhibiting colitis associated colorectal cancer by regulating TLR4 and IL-4R mediated macrophage polarization”的研究文章，旨在探究QFG抗CAC的潜在机制是否与巨噬细胞极化相关，通过动物及细胞模型，最终证实了，QFG中的多种单体成分可分别结合MD2或IL-4R，通过诱导巨噬细胞极化从而抑制CAC的发生发展。

1.QFG的活性成分与TLR4/MD2受体复合物或IL-4受体表现出强结合亲和力

为探究QFG抑制CAC发生的机制是否与巨噬细胞极化相关，研究人员先利用非靶向代谢组学对QFG粉末的成分进行了鉴定（图1A-B），其鉴定出的化合物与Biotree TCM和BT-HERB数据库中的1506个条目匹配。

有研究表明，TLR4/MD2受体复合物和IL-4R介导的通路在调节M1型和M2型巨噬细胞中至关重要，因此研究人员利用分子对接分析，对探究QFG与其的关系，结果共鉴定出10种活性成分与TLR4/MD2受体复合物以及IL-4R之间均具有强结合亲和力，表明QFG具有调节巨噬细胞极化的潜力（图1C）。

2.QFG改善CAC小鼠的症状并抑制肿瘤发展

为了更加清楚QFG的作用机制，研究人员构建了CAC小鼠模型，6只/组，共设计了4个实验分组，分别是Control组、Model+QFG组、Model组、QFG组（图2A）。喂养期间进行了体重记录、粪便隐血评分、腹泻指数评分；2个月后，分别记录了每只鼠的结肠长度、结肠表面肿瘤数量、肝脏、胸腺和脾脏的重量（图2B-C），并对结肠组织进行HE染色，同时采集血样用做其他分析。

结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的结肠长度显著缩短、肿瘤数量增多、脾指数显著升高、体重下降、腹泻和便血等情况均被QFG改善，且并未造成肝肾功能损伤（图2D-E）；此外，QFG对结肠的生理结构也有一定改善（图2F）。这些数据表明，QFG可以抑制CAC小鼠的肿瘤发展。

3.QFG调节CAC小鼠肠道组织的巨噬细胞极化

流式和免疫组化实验显示，M2样标志物CD206呈现显著下降，而M1样标志物CD11c则显著增加，表明QFG可以增加M1样巨噬细胞的存在并减少M2样巨噬细胞的数量（图3A)；此外，相较对照组，模型组中F4/80、CD68及离子钙结合适配分子(IBA1)的表达水平较对照组显著升高，表明QFG能有效减轻由AOM/DSS诱导的小鼠CAC结肠黏膜炎症（图3B-D）。

与此同时，在AOM/DSS诱导的CAC模型中，与对照组相比，巨噬细胞M2标志物、巨噬细胞M1标志物的表达量显著升高，但QFG处理后，CD206和精氨酸酶1的表达量显著降低(图3E-F），同时CD11c和CD86的表达量明显增加(图3G-H），这些结果表明，相较于模型组，QFG可促进M1样巨噬细胞的募集，同时抑制M2样巨噬细胞的浸润。这些结果与流式细胞术获得的数据一致。

4.QFG在体外促进Ana-1巨噬细胞向M1型表型极化

为验证QFG对M1样表型的促进作用，研究人员在体外实验中检测了QFG对Ana-1细胞中CD80、CD86、CD11c、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS水平的影响。流式实验显示，QFG处理后CD80、CD86和CD11c的荧光强度呈现显著剂量依赖性增强（图4A)。RT-qPCR分析表明，IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS的mRNA表达量也呈QFG剂量依赖性上升（图4B)。此外，TNF-α、MCP-1和IL-6的蛋白表达量也出现类似增长（图4C)。这些结果有力证明了QFG能够促进Ana-1巨噬细胞向M1样表型转化。进一步实验显示，经QFG处理后TRITC-葡聚糖的荧光强度呈现剂量依赖性增强，表明QFG能显著提升Ana-1细胞的吞噬活性（图4D）。此外，CT26细胞共培养实验表明，与单独使用CT26细胞的对照组相比，Ana-1+CT26联合治疗组的细胞凋亡率显著升高（图4E）。这些结果进一步证实，QFG不仅能诱导Ana-1巨噬细胞向M1样表型转变，还能增强其吞噬和细胞毒性功能。

5.当受到IL-4或CT26细胞培养上清刺激时，QFG在体外可抑制Ana-1巨噬细胞向M2型表型极化

研究人员进一步探究QFG处理是否能诱导Ana-1巨噬细胞向M2样巨噬细胞转化。RT-qPCR结果显示QFG处理抑制了Ym1和CD206 mRNA的表达，同时促进了精氨酸酶1和IL-10 mRNA的表达（图5A）。此外，研究人员利用两种体外模型：IL-4诱导的M2样巨噬细胞和CT26细胞培养上清液诱导的M2样巨噬细胞，进一步探究QFG处理抑制M2样巨噬细胞形成的潜力。结果发现，IL-4成功诱导了M2样巨噬细胞（图5B）。此外，两种模型在QFG处理后，精氨酸酶1和CD206 mRNA表达量均显著受到抑制（图5C)。这些结果表明，QFG能显著影响暴露于IL-4或CT26细胞培养上清液诱导的M2样巨噬细胞。

6.TLR4通路参与QFG诱导的M1型巨噬细胞极化

研究发现，TLR4和IL-4R分别参与调节M1型和M2型极化，为了探究QFG对巨噬细胞的极化作用是否与他们相关，研究人员用6种不同的TLR4及其下游通路物质拮抗剂对Ana-1细胞进行处理后，用QFG干预。结果显示，除KG501外，其他5种拮抗剂均不同程度地减弱了QFG诱导的IL-6、TNF-α、iNOS或IL-1β mRNA的上调（图6A-F）。表明QFG诱导巨噬细胞向M1型极化与TLR4和IL-4R及其相关的通路相关。

为深入探究MD2与QFG诱导巨噬细胞极化之间的关系，研究人员构建了Sh-MD2（MD2敲除）慢病毒转染Ana-1细胞，并用QFG进行干预。结果显示，与NC组相比，Sh-MD2组的MD2 mRNA和蛋白表达量显著降低（图7A-B），表明成功构建了MD2敲低的Ana-1细胞系。此外，相较于NC组，Sh-MD2组的IL-6、IL-1β和iNOS mRNA水平下降（图7C），而在MD2敲低的Ana-1细胞中，使用QFG处理并未导致IL-6、IL-1β、iNOS和TNF-α的mRNA水平显著升高，说明QFG促进巨噬细胞向M1样表型转化的作用与MD2密切相关。

7.IL-4R通路参与QFG诱导的M2型巨噬细胞极化

此外，研究人员进一步探究了QFG抑制IL-4诱导的M2样巨噬细胞是否与IL-4受体(IL-4R)及其下游STAT6和PI3K/Akt信号通路相关。通过Western blot检测STAT6、p-STAT6、Akt及p-Akt蛋白水平。结果显示，与对照组相比，IL-4诱导的p-STAT6和p-Akt水平显著升高），而经QFG干预后两者均显著降低（图8A）。这些结果表明，QFG可能通过拮抗IL-4受体介导的STAT6和PI3K/Akt信号通路，抑制Ana-1细胞向M2样极化的进程。

本研究中，研究人员验证了清解扶正颗粒(QFG)中的单体成分能够与MD2或IL-4R结合，通过TLR4介导的NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路激活巨噬细胞向M1型表型极化，或通过抑制IL-4R介导的JAKs通路抑制巨噬细胞向M2型表型极化，最终会抑制结直肠癌的发生和发展，为QFG在CAC治疗中的潜在应用提供了有价值的见解。

然而，研究也发现过多的巨噬细胞向M1型表型转化可能会对肠道组织造成炎症损伤，最终加剧CAC的严重程度。因此，精确调控QFG的给药剂量对于防止巨噬细胞过度激活为M1型表型至关重要。